I need a help until... 1 Jan 1970 03:00 Как SARS-CoV-2 впервые адаптировался к организму человека?

Вирусам необходимы специальные белки для проникновения в клетки, в которых будет происходить их репликация. У коронавируса острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) такой белок получил название шипиковый (spike), или S-белок. S-белок, будучи также мишенью современных вакцин, быстро адаптируется к своим новым хозяевам — людям. Первый большой шаг в этом направлении случился в начале 2020 года, когда произошла замена аминокислоты S-белка 614 (из 1297) с аспарагиновой кислоты (D) на глицин (G). Вирусы, несущие эту мутацию D614G, передаются от человека к человеку быстрее и в настоящее время составляют большую часть вирусной популяции. В данной статье Zhang с соавт. с помощью тщательного структурного анализа показали, как мутация D614G изменила S-белок и как это привело к ускорению пандемии.
На ранних этапах пандемии в отчаянных попытках получить инструменты для изучения SARS-CoV-2 исследователи разработали псевдовирусные системы, позволяющие измерять инфекционность вируса безопасным и поддающимся количественной оценке способом. Такие системы экспрессиют вирусный белок проникновения на поверхности вируса-«репортера» и в течение многих лет использовались для изучения множества подобных белков, включая S-белок «классического» SARS-CoV-1. К сожалению, псевдовирусы на основе S-белка SARS-CoV-2 дают гораздо более слабые сигналы, чем их аналоги на основе подобного S-белка у SARS-CoV-1. Это вызывало недоумение, поскольку биохимическое изучение связывающихся с рецепторами доменов (receptor-binding domains, RBDs) S-белков SARS-CoV-1 и SARS-CoV-2 убедительно продемонстрировало, что RBD SARS-CoV-2 взаимодействует с их общим рецептором, ангиотензинпревращающим ферментом 2 (АПФ2), с бо́льшим сродством, чем SARS-CoV-1 [2, 3]. Столкнувшись с неэффективными методами, многие вирусологи пришли к тому же решению, что и их коллеги, структурные биологи: изменить сайт S-белка, который расщепляется фуринподобными протеазами в клетках, производящих вирус. Такое изменение сохраняет S1-домен S-белка, содержащий RBD и связывающийся с АПФ2, в ковалентной связи с его S2-доменом, который заякоривает S-белок в составе вириона. Стоит отметить, что некоторые, но не все из этих мутаций по сайту расщепления фурином значительно увеличивали инфицирование клеток псевдовирусом.
Данное решение устранило техническую проблему, но усложнило загадку. Несмотря на то, что ряд отдаленно родственных коронавирусов содержат сайт расщепления фурином на границе S1-S2, у S-белка SARS-CoV-1 и всех вирусов линии Sarbecovirus, размножающихся в организме летучих мышей, этот сайт отсутствует. Вместо расщепления в клетках, продуцирующих вирус, их S-белки разрезаются другими протеазами, в то время как вирус взаимодействует с АПФ2 в следующей клетке, чтобы инфицировать ее. Таким образом, мутации в сайте расщепления фурином усовершенствовали функцию S-белка SARS-CoV-2 в псевдовирусах и дали возможность S-белку работать с ферментами поздних стадий проникновения в клетку так же, как у SARS-CoV-1. Почему же тогда мутация у SARS-CoV-2 в сайте расщепления фурина сохраняется, если она сделала инфицирование клеток в культуре менее эффективным? На самом деле, при регулярном пассировании культуры зараженных клеток вирусы теряли этот сайт. Улучшает ли это каким-то образом передачу вируса? Исчезнет ли он со временем в ходе пандемии?
Летом 2020 года Korber с соавт. забили тревогу о «проблемной мутации» — а именно о D614G. В лаборатории данное изменение избавило от необходимости устранять сайт расщепления фурином в S-белке, очевидно, исправляя конструктивный дефект, связанный с этим необычным сайтом. Эксперименты на животных с идентичными в прочих отношениях вирусами показали более высокий уровень репликации варианта D614G в верхних дыхательных путях — области, имеющей важное значение для распространения вируса. Напротив, в нижних отделах дыхательных путей, где размножение вируса ответственно за более тяжелое течение заболевания, значительных различий между двумя вирусами не было. Результаты этих наблюдений согласуются с текущим единым мнением, что присутствующая в настоящее время в большинстве циркулирующих вирусов D614G ускоряет передачу вируса, но, в отличие от более поздних мутаций в S1 [например, Asn501→Tyr (N501Y)], не влияет на частоту госпитализации.
Механизм, обеспечивающий более высокую приспособленность вируса, остается предметом споров. И здесь важным стало второе необычное свойство S-белка, присутствующее и у SARS-CoV-1. S-белок SARS-CoV-2, подобно большинству белков проникновения вирусов с липидными мембранами, образует тримеры. В типичном случае в процессе сборки вириона вирусные белки проникновения незначительно изменяют конформацию, но нарушать тройную симметрию перед связыванием с соответствующим рецептором для них необычно. Так или иначе, зрелый S-белок SARS-CoV-2 часто теряет симметричность, пока один из его RBDs приобретает «открытую» (в положении «вверх») конформацию. Лишь в такой конформации RBDs могут связываться с АПФ2. Как только связывание произошло, домен S1 диссоциирует от S2, а S2 претерпевает значительную перестройку и переходит в состояние после слияния. Высвобожденная при этом энергия используется для слияния мембран вируса и клетки и позволяет вирусу проникнуть внутрь.
Чтобы объяснить роль D614G в повышении приспособленности вируса, некоторые исследователи сосредоточились на влиянии D614G на частоту, с которой обнаруживается открытая конформация, предполагая, что повышение трансмиссивности вирусов, несущих эту мутацию, связана с более эффективным взаимодействием с рецептором. Другие отметили, что у вирусов, экспрессирующих D614G, S-белок распадается реже — возможно, данный эффект усиливается во враждебной среде живого организма. Они обнаружили, что мутация D614G помогала домену S1 удерживать S2, предотвращая преждевременное и непродуктивное приобретение конформации после слияния. Таким образом, вирус имел более функциональные S-белки, которые могли связываться со следующей клеткой и инфицировать ее.
Чтобы разрешить это противоречие, Zhang с соавт. исследовали структуру и провели детальный анализ обоих S-белков — как D614, так и G614 — в различных состояниях. Первым делом они отметили, что, в соответствии с предыдущими наблюдениями, потеря D614 в S1 разрывает ионную связь с проксимальным лизином, K854, в S2. Потеря этого солевого мостика кажется контринтуитивной, поскольку она будет ослаблять ассоциацию S1 с S2, хотя и может облегчать перемещение RBD в конфигурацию «вверх». Так или иначе, структуры, полученные Zhang с соавт. показывают, что главное различие между S-белками с D614G — заметно большая упорядоченность региона с 620 по 640 аминокислотные остатки, который авторы назвали «петля 630». Эта петля располагается сразу же за G614. Таким образом, становится возможным, что как потеря солевого мостика D614-K854, так и повышенная гибкость остова, обеспечиваемая глицином, помогает петле 630 прочнее закрепиться в углублении, сформированным двумя более крупными доменами S-белка (N-концевым доменом и С-концевым доменом 1). Тем не менее, петля оказывается в более жестком и стабильном положении между этими доменами, если в позиции 614 стоит G, а не D.
Разгадка в том, что придание обоим RBD открытой конформации и диссоциация S1 от S2, которая обеспечивается расщеплением с помощью фурина, требуют нарушения организации петли 630. Так, открытая конформация RBD легче достигается в случае исходного D614 S-белка, но как только она наступает, такой S-белок более склонен распадаться полностью из-за преждевременного отделения домена S1. С G614, напротив, больше энергии необходимо для достижения состояния, в котором один RBD находится в положении «вверх», но диссоциация S1 от S2 также становится менее благоприятна, поскольку оставшиеся петли 630 продолжают удерживать тример вместе. Получается, что у вирусов с мутацией D614G S-белков в положении «вверх» больше, так как следующий, необратимый шаг в сторону инактивации замедляется. Инфицирование вариантом D614G более эффективно, поскольку предотвращает преждевременное отделение S1.
 

Рисунок 1 | Усиление передачи вируса
Мутация Gly614 (G614) в spike-белке увеличивает упорядоченность петли 630 по сравнению с диким типом, Asp614 (D614). Это предотвращает преждевременное отделение S1, которое часто наблюдается в S-белках дикого типа и обеспечивает поддержание S-белка в состоянии готовности к слиянию («на шаг впереди»); при этом один домен связывания с рецептором (RBD) экспонируется в составе тримера, готового связаться с ангиотензинпревращающим ферментом 2 (АПФ2) клетки-хозяина, что усиливает эффективность инфицирования.
Описанные структурные исследования имеют практическое применение. Все существующие вакцины основаны на оригинальной, нестабильной форме D614 S-белка. К счастью, большинство разработчиков вакцин, включая Moderna и Pfizer-BioNTech, учли исследования SARS-CoV-1 и коронавируса ближневосточного респираторного синдрома (MERS), в которых внедрение новых пролиновых остатков в S2 замедляло отделение S-белка. Разработчики вакцин Johnson and Johnson и Novavax предусмотрительно также удалили сайт расщепления фурином. Основой вакцины, разработанной Оксфордским университетом и компанией AstraZeneca, напротив, является S-белок дикого типа (содержащий D614); то же можно сказать и о вакцине на основе инактивированного вируса от Sinovac. Для ясности стоит сказать, что другие переменные — особенно системы доставки антигенов — с большой вероятностью ответственны за различия в эффективности разных вакцин. Так или иначе, сравнительные исследования на животных показывают, что на эффективность вакцин влияют и присоединение пролиновых остатков, и удаление сайта расщепления фурином. Весьма вероятно, что следующее поколение вакцин, лучше соответствующих циркулирующим вариантам S-белка, будут включать D614G. Вакцины с немодифицированным S-белком с G614 могут показать относительный скачок действенности, так как данная замена компенсирует недостаток встроенных стабилизирующих мутаций.
Работа Zhang с соавт. также помогает лучше понять естественную историю вируса. Заметное появление D614G позволяет предположить, что приобретение дестабилизирующего сайта расщепления фурином — недавнее событие. Вирус легко мог потерять этот сайт, что часто происходит в культурах клеток и определенным образом приводит к усилению передачи вируса от человека к человеку. Это не тот вывод, которого ожидает большинство исследователей человеческих коронавирусов — при том, что данного сайта нет у SARS-CoV-1, который передается с достаточной эффективностью, а у менее родственного коронавируса MERS, который передается менее активно, сайт есть. Каким образом сайт расщепления фурина у SARS-CoV-2 способствует возникновению новых инфекций у людей остается главным открытым вопросом в данной области.

https://science.sciencemag.org/content/372/6541/466